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常見問題

ELISA實驗常見問題分析

ELISA實驗因靈敏度高,特異性強在生物科研上得到了廣泛的認可,但對初學者而言,如不注意實驗操作過程中的各個環節,可能會對最終的實驗結果產生比較大的影響,比如實驗出現白板,顯色弱靈敏度低,花板無梯度背景高等現象。下面對以上實驗現象進行一一解析。

1.白板現象
在完成所有實驗步驟進行底物TMB溶液顯色后,酶標板中所有孔的顏色均為無色,即無信號呈現。
出現該現象的可能原因:
a.試劑已過保質期,不同批次稀釋液交叉使用。
b.錯加漏加檢測A,檢測B或者底物溶液TMB。
c.洗板或者加樣過程中,酶標記物被污染失活,稀釋液中含有酶抑制劑如疊氮吶等。
d.配置稀釋液的蒸餾水可能被污染。
e.洗滌液是濃縮型的,沒有按比例進行稀釋。
f.酶標記物的活性和效價比較低。
g.溶液的PH值不正確,一般稀釋液的PH值應保持在7.2-7.4。
 
2.顯色弱靈敏度低
在完成所有實驗步驟進行底物TMB溶液顯色后,酶標板中孔的顯色比較淺,即只有微弱的信號呈現。
出現該現象的可能原因:
a.產品過有效期,試劑沒有按規定進行適當的保存。
b.試劑,標準品或者樣品在使用前沒有平衡到室溫。
c.少加了試劑的量或者加入試劑的稀釋比例不當。
d.洗板或者加樣過程中,酶標物受污染失活。
e.孵育時間和孵育溫度未達到實驗要求。
f.洗滌液稀釋倍數不符合要求,洗板次數過多,洗板沖擊力過大,洗板浸泡時間過長。
g.底物溶液TMB顯色時間太短。
 
3.花板無梯度背景高
在完成所有實驗步驟進行底物TMB溶液顯色后,酶標板中的孔有顏色但沒有梯度,背景也可能較高.
出現該現象的可能原因:
a.底物溶液TMB未置于陰涼避光處保存,實驗前溶液已經變藍。
b.孵育溫度過高或者孵育時間過長,發生了較強的非特異性吸附。
c.沒有按說明書要求洗板,特別是洗板時洗滌液的量少加了。
d.加樣時沒有換槍頭造成交叉污染。
e.花板現象:低濃度或者低活性的包被抗體或者檢測抗體,封閉不足導致的本底不穩定,洗板不充分,包被板子的問題。

綜上所述:在ELISA實驗中應注意以下問題:
1.在實驗前應該按相關要求將實驗試劑平衡至室溫。
2.包被抗體和檢測抗體應該是有高活性的且都針對同一抗原。
3.試劑保存:蛋白抗體類試劑保存于-20攝氏度,顯色液洗滌液保存于2-8攝氏度。
4.各試劑在使用前應充分混勻,以保證試劑的均一性和準確性。
5.嚴格控制反應溫度和反應試劑。
6.洗板次數,洗板液的量,洗板液浸泡時間的長短,洗板的力度都是應該注意的問題。
7.相關濃縮液應按要求稀釋到相應比例方可使用,PH值要保持在7.2-7.4之間。
8.在終止反應時盡量避免微孔中存有氣泡。
9.終止反應完成后應該在2min內完成酶標儀讀數。
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